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ATCC細胞冷凍保存是Z普遍的保存方法

原載自:www.bchzp.com[行情動態(tài)]  2016-01-26  瀏覽次數(shù):1818

   ATCC細胞冷凍保存是zui普遍的保存方法,南京科佰生物科技有限公司作為專業(yè)的ATCC細胞廠家,為大家專業(yè)分享下ATCC細胞的常見冷凍保存方法:
  冷凍保存方法分類
  (1)傳統(tǒng)方法:冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16~18小時(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1小時,以防止冰晶過大,造成ATCC細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
  (2)程序降溫:利用已設(shè)定程序的等速降溫機以-1~-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃,再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型ATCC細胞與hybridoma之保存。
  冷凍保存方法步驟
  (1)冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基,觀察ATCC細胞生長情形。
  (2)配制冷凍保存溶液(使用前配制):將DMSO加入新鮮培養(yǎng)基中,zui后濃度為5~10%,混合均勻,置于室溫下待用。
  (3)依ATCC細胞繼代培養(yǎng)之操作,收集培養(yǎng)之ATCC細胞,取少量ATCC細胞懸浮液(約0.1ml)計數(shù)ATCC細胞濃度及凍前存活率。
  (4)離心,去除上清液,加入適量冷凍保存溶液,使ATCC細胞濃度為1~5×106cells/ml,混合均勻,分裝于已標示*之冷凍保存管中,1ml/vial,并取少量ATCC細胞懸浮液作污染檢測。
  注意事項
  (1)欲冷凍保存之ATCC細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態(tài),約為80–90%致密度。
  (2)冷凍前檢測ATCC細胞是否仍保有其*性質(zhì),例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產(chǎn)生。
  (3)注意冷凍保護劑之品質(zhì)。DMSO應為試劑級等級,無菌且無色(以0.22micron FGLP flon過濾或是直接購買無菌產(chǎn)品,如Sigma D-2650),以5~10ml小體積分裝,4℃避光保存,勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級,以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用,因長期儲存后對ATCC細胞會有毒性。
  (4)冷凍保存之ATCC細胞濃度:
  ①normal human fibroblast:1~3×106cells/ml②hybridoma:1~3×106cells/ml,ATCC細胞濃度不要太高,某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后死去。
 ?、踑dherent tumor lines:5~7×106,依ATCC細胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度,而HeLa只需1~3×106cells/ml。
 ?、躱ther suspensions:5~10×106cells/ml,human lymphocyte須至少5×106cells/ml。
  (5)冷凍保護劑濃度為5或10%DMSO,若是不確定ATCC細胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時,亦應作一個backup culture,以防止冷凍失敗。
  冷凍ATCC細胞活化
  1、冷凍ATCC細胞之活化原則為快速解凍,以避免冰晶重新結(jié)晶而對ATCC細胞造成傷害,導致ATCC細胞之死亡。
  2、ATCC細胞活化后,約需數(shù)日,或繼代一至二代,其ATCC細胞生長或特性表現(xiàn)才會恢復正常(例如產(chǎn)生單株抗體或是其它蛋白質(zhì))。
  3、材料:37℃恒溫水槽、新鮮培養(yǎng)基、無菌吸管/離心管/培養(yǎng)瓶、液氮或干冰容器。
  ATCC細胞解凍步驟
  (1)操作人員應戴防護面罩及手套,防止冷凍管可能爆裂之傷害。
  (2)自液氮或干冰容器中取出冷凍管,檢查蓋子是否旋緊,由于熱脹冷縮過程,此時蓋子易松掉。
  (3)將新鮮培養(yǎng)基置于37℃水槽中回溫,回溫后噴以70%酒精并擦拭之,移入無菌操作臺內(nèi)。
  (4)取出冷凍管,立即放入37℃水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入無菌操作臺內(nèi)。
  (5)取出解凍之ATCC細胞懸浮液,緩緩加入有培養(yǎng)基之培養(yǎng)容器內(nèi)(稀釋比例為1:10~1:15),混合均勻,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取0.1ml解凍ATCC細胞懸浮液作存活測試。
  (6)解凍后是否立即去除冷凍保護劑,依ATCC細胞種類而異,一般而言,大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除,則將解凍之ATCC細胞懸浮液加入含有5-10ml培養(yǎng)基之離心管內(nèi),離心1000rpm,5分鐘,移去上清液,加入新鮮培養(yǎng)基,混合均勻,放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
  (7)若不需立即去除冷凍保存劑,則在解凍培養(yǎng)后隔日更換培養(yǎng)基。
 

 

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