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北京細(xì)胞庫(kù)中的細(xì)胞復(fù)蘇試驗(yàn)是怎么做的?

原載自:www.bchzp.com[行情動(dòng)態(tài)]  2020-02-17  瀏覽次數(shù):1409

   北京細(xì)胞庫(kù)所做的細(xì)胞復(fù)蘇是指將凍存在液氮或者-70℃冰箱中的細(xì)胞解凍之后重新培養(yǎng),細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)的過(guò)程。
  1.試驗(yàn)準(zhǔn)備:紫外線(xiàn)照臺(tái)30min,準(zhǔn)備好裝有高壓滅菌好的吸管、試管的飯盒、廢液缸;培養(yǎng)基臨用前放水浴箱里溫育20分鐘。在操作臺(tái)上擺放好物品,左邊為飯盒、培養(yǎng)液等,中間為酒精燈、試管架等,右邊放滴管架、鑷子,右上角放廢液缸。
  2.灼燒培養(yǎng)瓶口及瓶蓋,用滴管取培養(yǎng)基5ml加入試管中(一滴約為50ul)。
  3.戴手套,從-196℃液氮罐中取出凍存管,立即放入37℃水浴箱中快速解凍,同時(shí)不斷輕輕搖動(dòng)凍存管,保證凍存管內(nèi)細(xì)胞1min內(nèi)融化。以70%酒精擦拭保存管外部,移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)(慢凍快融)。
  4.用吸細(xì)胞液的滴管從凍存管中*吸出細(xì)胞懸液,加入到已裝有培養(yǎng)基的試管中,塞子塞試管,800rpm離心2min,棄上清,試管底部的白色物質(zhì)為細(xì)胞,輕彈混勻。往試管中加培養(yǎng)基、FBS(胎牛血清)各80滴和20滴(使FBS濃度為20%)。用吸細(xì)胞液的滴管輕輕吹打,使細(xì)胞混勻,以免在培養(yǎng)瓶里成團(tuán),影響細(xì)胞生長(zhǎng)。
  5.將試管中的細(xì)胞懸液用吸細(xì)胞液的滴管全部吸出,加到培養(yǎng)瓶中,標(biāo)記日期、細(xì)胞名稱(chēng),再把培養(yǎng)瓶放入CO2培養(yǎng)箱。
  6.收拾所用物品、用75%酒精噴灑操作臺(tái),擦臺(tái),保持臺(tái)面整潔。
  注意事項(xiàng):
  1.入細(xì)胞室前觀(guān)察CO2%壓力,5-7.5mPa左右,減壓器表壓力不低于0.1mPa。
  2.剛復(fù)蘇的細(xì)胞需要的營(yíng)養(yǎng)成分更多些,讓FBS濃度達(dá)到20%。
  3.離心時(shí)間為1-2min,速度為800轉(zhuǎn),不要離心太久,避免對(duì)細(xì)胞傷害較大。
  4.小心使用滴管,培養(yǎng)基和胎牛血清可以用一個(gè)滴管,但分開(kāi)用更好。
  5.不是所有的細(xì)胞復(fù)蘇后都能活。死亡原因有的是因?yàn)閮龃鏁r(shí)間太長(zhǎng)(如2年以上),技術(shù)不過(guò)關(guān)(如吹打太激烈)、細(xì)胞傳代數(shù)太多等。
  6.DMSO(二甲基亞砜)在常溫下對(duì)細(xì)胞毒性較大,而在4℃時(shí),其毒性大大減弱,故凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后應(yīng)及時(shí)洗滌冷凍保護(hù)劑DMSO(離心后棄去上清),防止DMSO在常溫下對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生較大毒性!

 

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